黄  博¹  陈高飞 ¹ 陈国勇¹  陈健康²  龙慧琴²  黄裕新³  张  磊¹

（第四军医大学：¹口腔医学系学员十四队，²基础部教学实验中心，³唐都医院消化科）

 

The protective effect of teapolyphenols on hepatic ischemia reperfusion injury in rats

¹HUANG Bo, ¹CHENG Gaofei, ¹CHEN Guoyong, ¹HUANG Yuxin，²CHEN Jiankang, ²LONG Huiqin

（¹Cadet Brigade Squadron Fourteen，²The center of Basic Medicine Experiment, ³Tangdu hospital Fourth Military Medical University, Xi’an 710033,China）

 

【Abstract】Objective: To investigate the protective effect and its role of teapolyphenols on hepatic ischemia reperfusion injury in rats Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: six rats were served as pseudo-operation normal control group, eight rats were served as hepatic ischemia reperfusion injury model group, eight rats were low dose teapolyphenols group（75 mg/kg） , eight rats were served as high dose teapolyphenols group（150 mg/kg）. After 30 minutes hepatic ischemia and 60 minutes reperfusion , the MDA level and GSH-PX vim in the liver of each group were detected , and the content of ALT in the serum also were examined . The injury circumstance of the liver tissue each group were compared by optical microscope.Results: The MDA level in the liver and the content of ALT in the serum of hepatic ischemia reperfusion injury model group is evidently high than the pseudo-operation normal control group（P <0.01）,  and the GSH-PX vim in the liver is depressed（P <0.01）; Comparing the hepatic ischemia reperfusion injury model group, The MDA level in the liver and the content of ALT in the serum of low dose teapolyphenols group and high dose teapolyphenols group is evidently low（P <0.01）,  while the GSH-PX vim in the liver is high（P <0.01）. The change could be observed by the optical microscope which liver cell injury of the low dose teapolyphenols group and high dose teapolyphenols group is evidently slight than the hepatic ischemia reperfusion injury model group. Conclusion:  the teapolyphenols have a prominent protective effect on hepatic ischemia reperfusion injury in rats.

【Key words】teapolyphenols;  hepatic ischemia reperfusion injury;  lipid peroxidantion ; free rad

 

【摘要】目的 探讨茶多酚对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法 健康雄性SD

大鼠30只，随机均分为4组：假手术正常对照组6只； 肝脏缺血再灌注损伤模型组8只； 茶多酚低浓度干预组8只（75mg/kg）； 茶多酚高浓度干预组8只(150mg/kg).缺血30min再灌注60min检测肝组织MDA含量、GSH-PX活性及血浆ALT含量。光镜下比较各组肝组织损伤情况。结果  肝缺血再灌注模型组ALT、MDA含量明显高于假手术正常对照组（P<0.01），GSH-PX活力则降低（P<0.01）； 茶多酚低浓度及高浓度组ALT, MDA含量均明显低于肝缺血再灌注模型组（P<0.01），而GSH-Px活力均高于肝缺血再灌注模型组（P<0.01）；光镜观察茶多酚低浓度及高浓度预处理组肝细胞损伤明显小于肝缺血再灌注模型组。结论  茶多酚对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有显著的保护作用。

【关键词】茶多酚；肝脏缺血再灌注损伤；脂质过氧化； 自由基

【中图号】R575     【文献标识码】A 

 

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)，是引起术后原发性移植物无功能、导致肝移植失败的重要原因。因此如何减轻HIRI是目前肝脏外科特别是移植外科急需解决的棘手问题！茶多酚(teapolyphenols，TP)是绿茶的主要生理活性成分。近年来，大量的研究发现，TP是一种天然的抗氧化剂，具有显著的抗氧化作用，可消除人体内产生过多的自由基，保护细胞膜的结构^[1-2]。然而，TP对HIRI是否具有保护作用及其机制尚不清楚。本实验旨在研究TP的抗氧化功能是否能对HIRI起到保护作用，并试图为临床寻求对HIRI有效防治方法提供实验依据。

 

材料与方法

 

一、实验动物及分组  

健康雄性SD (Sprague-Dawley)

大鼠30只，体重280±30g(由第四军医大学动物实验中心提供) ，随机均分为4组：假手术正常对照组6只； 肝缺血再灌注损伤模型组8只； TP 低浓度组8只(75mg/kg) ^[3-4]； TP高浓度组8只(150mg/kg) ^[3-4]。

二、药品、试剂及仪器：

茶多酚试剂（湖州荣凯生物提取有限公司）；丙二醛（MDA）及谷光甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（南京建成生物制剂有限公司）；其它试剂均为常用化学试剂；全自动生化检测仪（第四军医大学唐都医院检验科）。各指标均严格按照各试剂盒说明要求由专人进行统一检测。

三、动物模型的制备

大鼠肝缺血再灌注损伤模型：参考Collettet LM ^[5]的方法建立。建模前12小时禁食，正常供水。戊巴比妥纳腹腔注射麻醉（1ml/kg）,建立尾静脉输液通道，各组动物尾静脉注射2 ml肝素生理盐水(100 U／L)。TP低浓度组于缺血再灌注前静脉注射茶多酚75mg/kg(2ml)；TP高浓度组于缺血再灌注前静脉注射茶多酚150mg/kg(2ml)。假手术组和肝缺血再灌注损伤模型组静脉注射等量生理盐水。打开腹腔，游离肝蒂； 除假手术组外，其余三组分别用无创血管夹夹闭肝蒂，并开始计时。肝蒂夹闭后肝脏颜色逐渐变深、肿胀、质地变硬；30 min后，松开血管夹恢复血供，肝脏颜色逐渐恢复至缺血前状态，关腹；假手术组仅行肝蒂骚扰，不夹闭。于恢复血流60min心腔取血，3 000 r／min离心1 0 min，留取血浆成份，测定血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量。同时切取肝组织：一部分置于福尔马林液中，以备光镜观察肝脏组织结构损伤情况，另一部分用滤纸擦干，称重(精确到0．Ol g)，肝组织置于1∶10生理盐水中。用匀浆器充分碾碎肝组织，400O r／min离心l5min，抽取上清液，测定肝匀浆中MDA的含量及GSH－Px含量。

四、观察指标 

（1）通过测定MDA、ALT、GSH-Px三个指标来检验TP的抗氧化保护作用。测定肝组织中MDA含量可以间接了解体内氧自由基水平，肝组织中GSH-Px的活性反映肝脏抗氧化能力，血清ALT含量则反映肝细胞被破坏程度。（2）留取肝组织进行常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察肝脏病理组织学变化。

五．统计学处理

所有数据输入SPSS10.0统计软件处理，结果用平均值±标准误表示，组间数据应用Newman-Keuls检验，以P＜0.05作为有统计学显著性。

 

实验结果

 

一、生化指标检测结果

肝缺血再灌注损伤模型组MDA、ALT含量明显高于假手术正常对照组（P<0.01），GSH-Px活性则降低（P<0.01）； TP低浓度及高浓度干预组MDA、ALT含量均明显低于肝缺血再灌注损伤模型组（P<0.01），GSH-Px活性均高于肝缺血再灌注损伤模型组（P<0.01）；而两个TP干预组的各项指标均接近于正常对照组。见附表。

 

表1  茶多酚对肝缺血再灌注损伤MDA、ALT、GSH-Px 含量比较（x±s）

^aP,^bP, ^cP <0.01vs 假手术组; ^bP, ^cP<0.01vs ^aP   ^cP<0.05vs ^bP

 

二、光镜观察结果

 

假手术组，肝小叶结构清晰，肝静脉存在，肝板清晰，肝窦尚存，未见肝细胞变性和炎细胞浸润。再灌注组，肝小叶结构紊乱，肝细胞浊肿，部分肝细胞变性，点状坏死，肝窦内淋巴细胞明显浸润。而茶多酚低浓度干预组，肝小叶结构基本恢复正常，肝细胞轻度浊肿，汇管区扩大，肝窦内散在淋巴细胞浸润。茶多酚高浓度干预组，肝小叶结构清晰，肝细胞形态基本正常，肝静脉存在，汇管区轻度淋巴细胞浸润，血管轻度充血。

讨  论

 

迄今为止对HIRI的发病机制尚不完全清楚。但大量研究表明自由基、脂质过氧化对肝细胞的损伤是HIRI发生的重要原因。肝缺血时，无氧代谢产物聚集，再灌注时，氧分子进入缺血组织，发生超氧化物阴离子自由基反应，使自由基产生过多和抗氧化系统受损，导致脂质过氧化反应，造成肝细胞肿胀、变性、坏死，构成缺血再灌注损伤^[6-8]。脂质过氧化反应的最终产物是MDA等，具有生物毒性，与蛋白质、核酸等含氨基化合物反应，使细胞骨架蛋白结构和功能发生改变。MDA在体液和组织中含量增多，表明体内脂质过氧化反应增强，所以检测MDA可判断是否发生脂质过氧化反应^[6]。本实验肝缺血再灌注组肝组织匀浆MDA含量明显高于假手术正常对照组，表明肝缺血再灌注组对肝脏已造成了损伤；而TP预处理组MDA含量低于肝缺血再灌注模型组，且肝组织GSH-Px活力和血浆ALT含量也更接近假手术正常对照组；同时，肝组织病理改变，也表明TP干预后的肝组织无明显损伤，从而证明茶多酚对HIRI具有保护作用。推测TP对大鼠HIRI的保护作用机制可能通过下述几种途径体现：第一，直接清除活性氧自由基：有报道TP复合物及儿茶素单体对氧自由基清除率高达98％以上。TP是一种能提供氢的自由基清除剂， 其结构中富含酚羟基，可提供活泼氢使自由基灭活，本身被氧化形成含有邻苯二酚结构的自由基而具有较高稳定性。TP对无机自由基·OH、O^- 和H202等活性氧以及有机自由基包括多元不饱和脂肪酸的氧化产物ROO·和RO·等起着不同的抗氧化效果—— 预防性抗氧化和链阻断式抗氧化作用^[9]。比较TP和几种常用的抗氧化剂，如维生素E、维生素C，TP对活性氧自由基的清除能力明显大于常用的抗氧化剂^[10]。第二，抑制脂质过氧化反应：TP不仅可清除链引发阶段的·OH、O一等自由基，而且还是断链型抗氧化剂，可清除链反应中间产物脂过氧自由基和烷氧自由基，从而阻止脂自由基的传播扩增，其抗脂质过氧化能力超过trolox(IC为 75.65mM)、硫辛酸(Ic 为7.63 mM)和褪黑素(Ic 为15.48 mM)等常见的抗氧化物质^[11]。第三，TP与诱导氧化的过渡金属离子络合：TP具有邻苯二酚结构，有较强的络合金属离子的性能。过渡金属如铁、铜等是许多自由基产生过程的催化剂，如Fe^2＋ 介导脂质过氧化（Fenton反应），也是·OH等自由基产生的媒介物，而TP可螯合Fe^2＋ ，使之形成无活性的铁复合物，从而影响氧化过程。

总之，TP一定程度上能抑制肝脏缺血再灌注所致的肝组织损伤，拮抗脂质过氧化反应，从而对大鼠HIRI具有保护作用。因此，临床预防性应用TP有望减轻HIRI。为临床广泛的缺血再灌注损伤性疾病的防治提供了可能的新途径。

参 考 文 献

 

1.          Zhaobaolu, Antioxidant effects of green tea polyphenols, Chinese Science Bulletin.2003,48(4).-315-319

2.          周彤 熊丽萍.茶叶的抗氧化作用研究. 世界元素医学,2005;12(2);42-45

3.          Zhao Y N，Ke Y S，Zhe Q S，el a1．Study ontea polyphenols long—term toxicity of dogs [J]．Chin J Clin Pharmacol Ther，2000，5(1)：43—46

4.          何冰, 陈小夏. 茶多酚对小鼠实验性肝损伤的保护作用[J]. 中药药理与临床.2004；20(4):19-20

5.          Colletti LM, Remick DG, Burtch GD, Kunkel SL, Strieter RM, Campbell DA Jr. Role of tumor necrosis factor—alpha in the PathoPhysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat，J Clin Invest 1990；85：1936—1943

6.          Willian P， Paaske Pre Sejrsen．Microvascular function in the peripheral vascular bed during ischcmia and oxygen—free perfusion．Eur J Vasc Endovasc Surg，1995；9；29

7.          Kunz R, Brune HA, Ziegler U, et a1. Ischemia/ repcrfusion damage of the liver caused by free radicals--direct detection using electron spin-reso nance  (ESR). Langenbecks Arch Chir，1991：376：139

8.          Reilly PM ．Bulkley GB．Tissue injury by free radicals and other toxic oxygen matabolites．Br J Surg， 1990；77：1324

9.          Chen Y S, Zhang Y P. The antioxidation of tea- polyphenols[J]．Chin J Nephrol，(中华肾脏病杂志)，1998(1)：65—67．

10.       石碧，狄荧著．《植物多酚》[M]．北京：科学出版社．2000：175．

11.       Lee S R，Im K J，Suh S I，et a1．Protective effect of green teapolyphenol(-)-epigallocatechin gallate and other antioxidants on lipid peroxidation ingerbil brain homogenates[J]．Phytotherapy Res，2003，17(3)：206-209