RNA干扰（RNA interference RNAi，也译作RNA干预或者干涉）是由双链RNA（double-stranded，dsRNA）启动的选择性基因沉默作用，是一种基因水平的调控机制。1995年，Guo首次在实验中发现，正义RNA具有与反义RNA同样阻断基因表达的作用^[1]；直到1998年，Fire通过对正义RNA作用机制的进一步研究，证实了真正发挥阻断基因表达作用的是在合成正义RNA过程中所形成的dsRNA，并由dsRNA启动，对同源基因表达进行特异的阻断和抑制^[2]，由此揭开了RNAi的研究序幕。大量研究发现，RNAi作为一种古老的防御机制广泛存在于线虫、真菌、植物等多种生物体内，通过特异性分解入侵的外源核苷酸序列，起到“细胞免疫”的作用；另外，RNAi也是细胞分化的调控机制之一，在不同时期对基因的表达起着调控作用。RNAi技术已经在抑制病毒复制、传播，功能基因组的高通量分析，肿瘤的治疗，以及各种基因表达异常增高引起的疾病等多个研究领域取得了瞩目的成果。本文就RNAi的作用机制及抗病毒效应作一综述。

 

1 RNAi的可能作用机制

 

基因沉默可在两种水平上发生，一种是基于DNA甲基化，位置效应及异染色质化等机制引发的转录水平的基因沉默；另一种是转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing ，PTGS），它是在基因转录后，通过特异地影响靶mRNA或阻止其翻译而使目的基因表达受阻的转录后水平的基因沉默。RNAi作用就是一种同源性依赖的转录后水平的基因沉默^[3]。

在现有的研究成果的基础上，有学者提出了RNAi作用的可能模型。在对线虫、果蝇进行大量研究后，产生了现有RNAi作用机制模型，该模型包括起始阶段和效应阶段^[4]。在起始阶段，导入的dsRNA被切割成21-23 nts的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。有证据表明，一个被称为Dicer的核酸内切酶能以ATP依赖的方式逐步切割由外源导入的双链RNA，将其降解为19-21nts的小片段，该片段具有5’-磷酸，3’-羟基和1-2个核苷酸的3’-粘性末端。Dicer是RNAse Ⅲ家族成员之一，在进化上相对保守，包括2个活性区域、1个RNA解旋酶活性区域及一个PAZ活性区域。研究发现，重组人Dicer（re-hDicer）能体外切割dsRNA而生成有活性的siRNA，这表明Dicer参与了RNAi过程^[5，6]。对大多数哺乳动物来说，长片段的dsRNA的引入可激活RNA依赖的蛋白激酶（RNA-dependant protein kinase，PKR）和2’，5’寡腺苷酸合成酶，而引起非特异性反应。PKR可通过一系列磷酸化使得翻译起始因子eIF-2α（initiation factor-2α）失活而导致RNA大范围、非特异性的翻译阻遏，而2’，5’寡腺苷酸合成酶可活化RNAse L，进而非特异性降解RNA。 随着研究的深入，人们逐渐认识到，在基因沉默发生过程中，大约21nts大小的siRNA直接起“干扰作用”，引入小片段的siRNA不仅能特异性的抑制同源基因的表达，而且也不会导致由PKR引起的非特异性反应^[7，8]，这无疑会加快哺乳动物基因功能的研究，为疾病的基因治疗带来新的希望。

在RNAi效应阶段，被Dicer加工成的siRNA与解旋酶、核酸酶等一起组成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。此外，亦有文献报道^[9]，来源细胞核的发夹（hairpin）RNA亦可经细胞内酶的作用后产生内源性siRNA，进而在胞质内形成RISC。RISC激活时需要解旋酶以ATP依赖方式将siRNA解开，激活的RISC通过碱基配对将反义链定位到同源的mRNA转录本上，引导核酸酶在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA，被切割的mRNA不产生任何中间产物，这提示RISC复合物中可能还含有核酸外切酶。

RNA干扰至少具有以下几个重要特征:（1）高专一性。与靶mRNA之间一个碱基错配都会明显削弱基因沉默的效果。不过并非所有符合条件的siRNA都同样有效，具体原因还不清楚，可能是位置效应（postitional effects）所致。（2）高效性。实验表明，极少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，达到缺失突变体表型的程度，而仅凭几个dsRNA被Dicer切割成数十个siRNA并不能作出令人信服的解释，为此，有人提出随机降解PCR （random degradative PCR）模型。认为一种称之为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，PdRP）以siRNA为引物扩增模板mRNA，产生的dsRNA供给Dicer，结果产生更多的siRNA。（3）传递性。 RNAi具有很强的细胞穿透力，可以在不同细胞间传递和维持，甚至可以传至子代。

 

2 RNA干扰的抗病毒应用

1. RNAi抑制HIV-1复制的研究

自从证实在哺乳动物细胞中能诱导RNAi效应以来，国内外许多著名的研究小组都试图通过RNAi技术来抑制HIV的复制，最常用的方法是先通过病毒的RNA确定RNAi作用的目的基因。RNAi可以作用于新合成的病毒mRNA和细胞基因组的RNA，产生抑制效应。研究表明^[10]，编码结构蛋白的有Gag，Env，Pol酶，调节蛋白Tat和Rev及两个附属蛋白Nef，Vif。最近，有报道RNAi在长期的病毒复制过程中还作用于非翻译的RNA序列，在抑制病毒复制的调节机制中也起到重要作用。目前大部分的研究都是根据HIV-1目的基因导入化学方法合成的21 bp的siRNA，这些合成的siRNA可以使病毒产物减少100倍左右^[11]。RNAi还可以作用于细胞的基因发挥效应。对于HIV-1，这些靶基因包括mRNA编码的CD4受体和CCR5或CXCR4联合受体^[12]，这些受体对病毒颗粒黏附于并进入细胞是必不可少的。由于RNAi抑制病毒的RNA并不能保护细胞免遭病毒的攻击，所以如果能使这些受体基因沉默，那么HIV-1病毒将不能顺利进入细胞，从而产生防御病毒攻击的效应。Novina等研究证实，通过将某个受体作为靶基因确实能抑制HIV-1的复制，减少8倍的CD4只能减少4倍的病毒入侵。但是，CD4是参与细胞信号传导的一个重要分子，沉默CD4的表达，无疑会对其它免疫功能产生较大影响。而CXCR4/CCR5联合受体则可能是一个很合适的靶基因，但是抑制CCR5并没有产生明显的效果，减少63% 的CXCR4和48%的CCR5也只能减少2-3倍的病毒侵入^[12]，和直接抑制HIV-RNA相比，抑制受体所产生的基因沉默效应似乎效果不佳。另一个参与病毒复制的重要的转录因子是NF-_KB，然而通过抑制NF-_KB的p65 亚单位也只能使HIV-1的产物减少5倍，但NF-_KB是调节细胞基因表达的转录因子，通过抑制NF-_KB来抑制病毒的复制并不合适。目前的研究只能说明RNAi在细胞培养中能特异性的抑制HIV-1的复制及其产物表达。

2. RNAi抑制其他病毒复制的研究
    虽然大多数研究RNAi抗病毒作用的焦点在HIV-1，但是最近关于其他病毒的研究也时有报道，在这些研究中，多数实验还是针对病毒的RNA使用合成的siRNA，也有一些研究是用较长的dsRNA片断（77–500 bp）和细胞内的shRNA。登革热病毒属于黄病毒科，在人类它能引起登革热和出血热，其基因组由11 kb的（+） ssRNA编码。Gaines等证明在蚊虫的体内使用针对某些基因的dsRNA可以产生抑制病毒的效应，和植物体内的机制相似，来源于登革热病毒的正义RNA和反义RNA均可以有效的降低病毒的表达水平，而利用细胞内的针对相应病毒核苷酸序列的dsRNA片断则可以产生更有效的抑制作用。

    HCV是导致慢性肝炎和肝脏恶性肿瘤的主要病毒之一。HCV也是黄病毒科 a （+） ss RNA基因组成员。由于没有针对HCV复制的体外肝细胞培养系统，所以只能用Huh-7细胞作为HCV复制的宿主细胞，研究结果显示，这些复制子促使HCV RNA转录和蛋白合成，但是产生的病毒却没有感染性。Kapadia等利用针对HCV的衣壳蛋白2个siRNA（NS3-1948和NS5B-6133）和GAPDH的siRNA分别与表达HCV的质粒共转染Huh-7细胞，对标本作实时定量RT-PCR，发现NS3-1948和NS5B-6133抑制cDNA效果分别达21和23倍，而GAPDH特异的siRNA没有减少HCV的RNA含量，从而有力证明，HCV特异的siRNA可以有效的抑制病毒的复制（减少RNA病毒RNA含量）。

除了能有效的抑制HCV复制，针对细胞基因的RNAi还可以降低病毒诱导的疾病的发生率^[13]。HBV和HCV感染可以引起Fas介导的肝细胞凋亡，而这种自杀式的反应在从老鼠尾部血管注入针对Fas mRNA的siRNA后却得到明显的抑制。有趣的是，初步的研究结果暗示在HCV系统中可能存在RNAi在细胞间的逐步蔓延，研究证实，在细胞被转染了siRNA后，整个细胞培养系统中的HCV蛋白表达大幅下降。这项研究让我们得到一个启示，进一步研究RNAi在哺乳动物细胞中的信号传播机制将会为我们用少量的的具有RNAi的细胞来保护大量的正常的肝细胞免受病毒入侵提供思路。

A型流感病毒主要引起人类呼吸系统感染，其基因组被八个独立的（–）ssRNA编码。目前研究表明，合成针对A型流感病毒基因组保守区的siRNA在细胞培养体系和鸡胚种能抑制病毒复   制^[14]，在20段siRNA的实验中，核蛋白体（nucleocapsid，NP）和RNA聚合酶（PA）能使基因组的八个病毒RNA不能有效的结合在一起，从而抑制病毒转录和复制，也因此被认为是最佳的作用位点。
    口蹄疫病毒（FMDV）是一种在偶蹄动物间传播并具有高度传染性的RNA病毒。FMDV基因组由一个包含特殊开放阅读框的正义RNA链（8500nt）组成，开放阅读框编码四种结构蛋白，包括VP1，VP2，VP3，VP4。其中，VP1参与病毒复制，并且在病毒黏附易感细胞的过程中起到重要作用，Chen等针对VP1合成出相应的siRNA，并转染于体外培养的BHK-21细胞，结果显示VP1表达下降80-90%，而且，转染过的BHK-21细胞可以抵御100TCID50的病毒感染，并且可以使抗病毒效应延长至转染后48小时^[15]。在给乳鼠皮下注射相应siRNA的质粒，可以明显减少对FMDV的易感性。表明RNAi不仅仅具有病毒感染后的治疗作用，而且还显示出良好的预防病毒感染的作用。

 

3 RNAi抑制SARS病毒复制的研究

 

SARS病毒（SARS-CoV）是重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）的病原体，它主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播。世界卫生组织于2003年4月16日正式宣布SARS的病原体是一种新的冠状病毒，并正式命名为SARS病毒。SARS-CoV基因组是正链单链RNA，全长约30kb，其基因组结构为：5'-帽状结构-病毒酶-刺突糖蛋白（S）-包膜蛋白（E）-基质膜蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）-3'poly A尾。其中，M和E对包膜的形成至关重要，N蛋白和M蛋白作用后将核衣壳装配成病毒，而S蛋白则参与宿主细胞的结合^[16]。理论上，针对以上基因的siRNA应该可以产生一定的效果，Zhang等研究证明，应用针对SPIKE（S）蛋白的siRNA可以抑制SARS病毒在体外细胞中的复制^[17]；Lu等研究也表明，在Hela细胞和293中使用针      对SARS病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（ RNA-dependent RNA polymerase ，RDRP）基因的shRNA，可以抑制RDRP的表达，而在Vero-E6细胞中则可以减少SARS病毒斑的形  成^[18]。虽然目前的研究结果还只能证明RNAi在体外培养细胞体系中能够抑制SARS病毒复制，但是有理由相信RNAi将会在动物实验和临床实验中取得令人满意的结果。与RNA病毒不同，RNAi抑制DNA病毒的机制主要是降解病毒的mRNA，而不是病毒基因组。HBV病毒的基因组是由大约3.2-kb形成的双链环形DNA。有四段RNA可以分别转录编码衣壳蛋白，聚合酶，表面抗原和转激活因子x。HBV是最先用于RNAi在哺乳动物细胞中效应的DNA病毒，通过载体转染针对X mRNA的shRNA，在Huh-7细胞中的HBV表达水平可以减少20倍左右，而通过联合转染HBV DNA和表达shRNA的质粒，可以抑制小鼠肝脏中的HBV表达，并可以使外周血中的HBV表面抗原水平减少6倍。这些动物实验表明，RNAi可能是一种极为有效的抗病毒技术。

 

5 RNAi技术抗病毒应用存在的问题及展望

 

作为一个新兴的、机制尚未完全清楚的新技术，RNAi技术有以下不足：（I）由于siRNA通常采用在线没计，BLAST程及siRNA设计软件的优劣、病毒基因组数据库的可获得性及准确性都影响siRNA设计结果。据Snover^[19]的报道，发表过的359段siRNA序列中有75％存在诱发非特异性效应的风险。（2）siRNA的生产成本相当高昂。（3）同一段靶mRNA不同位置的相应siRNA其基因沉默效率显著不同^[20]。siRNA的合理设计尚需进一步完善。通常需要设计多条siRNA序列来筛选最有效的siRNA，这进一步增加了研究成本。（4）siRNA的实验规程需进一步完善，siRNA的载体设计还不够成熟；如果以病毒体系为载体必须考虑生物安全性的问题：siRNA本身易降解，商业上提供的siRNA一般在1周内或短于一周有效。

1. 病毒逃逸
    病毒逃逸是病毒由于错误倾向的复制机制引起相应关键基因的改变，有研究表明RNA病毒和逆转录病毒逃逸比DNA病毒逃逸现象要多一些，例如，有报道称脊髓灰质炎病毒和HIV-1的变异可以抵制RNAi^[11]，针对脊髓灰质炎病毒相应基因合成的siRNA可以使病毒产物减少100倍，但是在延长孵育时间后，病毒的滴度却升到较高的水平。通过分析传代病毒的基因序列发现，在RNAi的靶基因中确实存在有简单的基因突变。越来越多地证据表明，有多种不同的基因突变参与了HIV-1的逃逸^[11]，在研究中可以发现使用针对Nef 的shRNAs，T细胞系中HIV-1复制明显减少，但是在感染病毒23天时，Nef的靶基因中却发现有基因突变。理论上，联合应用针对多个靶基因的siRNA应该可以减少病毒基因突变。当然，针对宿主的基因可以诱导基因沉默，但是这种方法可能产生更为严重的副作用。

2. 病毒干扰基因沉默
    针对RNAi的抗病毒功能，病毒似乎也在千方百计的干扰这种效应。Li等在植物病毒的研究中发现病毒中的一些物质有干扰基因沉默作用并能使病毒滴度增高，例如黄瓜镶嵌病毒（CMV）的2b蛋白，马铃薯病毒X的p25，马铃薯病毒Y的HcPro。这种干扰作用可以存在于基因沉默途径的任何环节。有理由相信，很多病毒都可以编码某种基因沉默抑制物，如果是这样，我们应该对发现如此众多的基因沉默效应感到惊奇，一种可能是基因沉默抑制物阻滞了siRNA上游序列的产生，Jackson AL的研究证明，劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）的引入的RNA受到核壳体的保护而免受RNAi的降解^[10]，另一种可能是转染的细胞的RNAi机制处于高度激活状态，使得病毒的基因沉默抑制物水平无法达到抑制作用，而且，其抑制RNAi也可能是不完全的。随着对RNAi临床抗病毒治疗的深入研究，基因沉默抑制物逐渐引起研究人员的重视，因为联合应用针对基因沉默抑制物和其他相关基因的RNAi可能产生更为有效的抗病毒作用。
3. 衰减效应
    目前大部分RNAi研究都是将化学合成的siRNA导入细胞，这种人工合成的siRNA可以产生特异性很强的抑制作用，但是持续的时间一般不会很长，大量的实验证实，导入细胞的dsRNA阻断基因表达是短暂的^[15，17]，而且不稳定遗传，因此分析RNAi后期的基因功能是有限的。Jackson等在研究RNAi抑制HIV-1复制时发现，通过独立的正义和反义RNA片断形成dsRNA或shRNAs，产生细胞内表达的siRNA来诱导基因沉默。结果表明，通过细胞内产生siRNA诱导的RNAi比从细胞外转染合成的siRNA所产生的RNAi有着更长效的基因沉默效应^[3]，这很容易理解为细胞内的dsRNA和shRNAs能长期的源源不断地提供siRNA以维持RNAi的效能。然而，这种方法也存在一些局限性，例如特异性不强和调控较为复杂等。所以，如何获得长效的抑制效应也是目前有待解决的问题。

此外，在临床应用该技术之前还需谨慎的考虑一些问题。一些低水平表达基因的RNAi现象并不明显，针对病毒RNA的siRNA应用于人体足否像线虫的RNAi那样高效?可能存在一些基因或组织具有抵抗RNAi的能力，线虫的神经系统即具有这种能力^[2]。人体是否含有类似于RdRp的酶?生物各系统具有高度相关性，导人体内的siRNA与其他系统是否有相互作用? 对这些问题的研究解答，有助于促进RNAi技术的实际应用。

自从2002年第一次报道RNAi在哺乳动物细胞中能抑制病毒复制以来，RNAi已经广泛用于各种抗病毒研究，并取得大量令人振奋的结论。用于基因治疗的反义药物，核酶（Ribozyme，Rz）已经进入临床。siRNA有可能成为比Rz更优越的基于基因信息的抗病毒工具。与反义技术相比，siRNA的优化设计周期很短，为未来应对类似于严重急性呼吸系统综合征（SARS）、禽流感（avian influenza）的突发性病毒传染事件提供了契机。基于siRNA设计抗病毒反义药物是一种合理药物设计方式，预计比传统的从化合物库中筛选的非合理药物设计方式节约成本和时间。除基因沉默外，RNAi还可以高通量表型测试的方式筛选药靶、验证药靶，在这些领域，RNAi可能成为取代基于同源重组机制的基因敲除技术平台^[21]。

总之，在短短几年中RNAi技术就取得了长足的进展，采用这一技术进行抗病毒的基因治疗是大有潜力的。然而，应用于动物实验及临床治疗遇到的问题要复杂得多，机体各种调节机制都可能影响到RNAi的效果，而且目前仍然有许多问题尚待解决。RNAi的发现改变了人们对基因调控的传统认识，提供了特异的沉默基因表达的方法，在后基因组基因功能研究和基因水平治疗疾病中将成为研究的有力工具，在医学的各个领域各个环节会将得到广泛的应用。如果能有效的解决这些问题，并随着研究的深入，有理由相信，RNAi技术在病毒感染引起的疾病的基因治疗具有广阔的应用前景。

 

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